Dal trascrittoma all’interattoma di miRNA: identificazione sperimentale e bioinformatica delle interazioni funzionali miRNA:mRNA

Abstract

I miRNA, piccole molecole endogene di RNA non codificante, regolano l’espressione genica attraverso la degradazione dei messaggeri (mRNA) o l’inibizione della traduzione. I miRNA maturi interagiscono con le proteine del complesso RISC (RNA-induced silencing complex) tra cui le proteine Argonaute (Ago), capaci di legare direttamente i miRNA e di mediare la regolazione dell’espressione genica in seguito alla interazione del miRNA con il proprio mRNA target. Un singolo miRNA può legare diversi mRNA e ciascun mRNA può essere regolato da diversi miRNA. La maggior parte dei software di predizione oggi disponibili individuano i putativi target di singoli miRNA ignorando caratteristiche di tipo globale, come i livelli di espressione di mRNA e miRNA coespressi. Obiettivo del nostro lavoro è sviluppare un sistema per lo studio e la predizione delle interazioni funzionali miRNA:mRNA che tenga conto di tutti i miRNA e degli mRNA coespressi in una cellula in determinate condizioni. Allo scopo di misurare e mettere in relazione i livelli di espressione di mRNA e miRNA, abbiamo messo a punto una immunoprecipitazione ad alta efficienza del complesso RISC-Ago2 da estratti citoplasmatici della linea cellulare di tumore mammario MCF-7. I profili di espressione di mRNA e miRNA dei campioni ottenuti sono stati ricavati mediante microarray. Tale tecnica ci ha consentito di caratterizzare separatamente l’insieme di mRNA e miRNA legati e non legati ai complessi RISC. E’ stata inoltre utilizzata la centrifugazione su gradiente di densità per separare gli mRNA in fase di traduzione da quelli non tradotti e i miRNA associati a ciascuna di queste frazioni. Anche questi campioni saranno analizzati mediante microarray. L’analisi dei dati ottenuti ci consentirà di individuare tra tutti i miRNA ed gli mRNA espressi nella cellula quelli coinvolti nel processo di regolazione ed identificare le interazioni miRNA:mRNA che inducono un blocco della traduzione o la degradazione del messaggero target. Utilizzando i dati ottenuti ci proponiamo di mettere a punto un modello matematico per predire l’insieme delle interazioni funzionali tra i miRNA e i relativi target in qualsiasi condizione cellulare in cui siano noti i profili di espressione dei miRNA e degli mRNA.