Isolamento di cellule staminali provenienti dal dotto di Wirsung del maiale e differenziazione in vitro in cellule beta simili

Abstract

Introduzione: Lo scopo di questo studio è quello di ottenere un protocollo per l’isolamento e la coltura in vitro di cellule staminali provenienti dal dotto di wirsung del maiale ed osservare la potenzialità di tali cellule nel differenziarsi in cellule β-simili producenti insulina. Materiali e metodi: Il dotto di wirsung è stato isolato attraverso microdissezione chirurgica dopo prelievo del blocco duodeno-pancreas di maiale mediante perfusione in situ prelievo e successivamente digerito prima con 1 mg/ml di collagenasi P e poi con 2mg/ml di tripsina per ottenere cellule staminali duttali, le quali successivamente sono state poste in coltura (serum-free) con DMEM senza glucosio con l’aggiunta di fattori di crescita. Successivamente le cellule sono state poste in coltura con concentrazioni crescenti di glucosio (0-controllo, 5,6 mM/L, 17,8 mM/L e 25 mM/L) e successivamente identificate mediante colorazione immunoistochimica Risultati: Nelle prima due settimane si è osservata una crescita cellulare molto lenta; dopo l’induzione con glucosio a differenti concentrazioni per due settimane, si è notata la capacità di tali cellule ad aggregarsi ed a costruire strutture simil-insulari. Queste cellule sono state colorate utilizzando i comuni markers pancreatici duttali ( CK19, insulina, glucagone). Dopo la seconda settimana il 90% delle cellule delle strutture tridimensionali pancreatiche risultarono positive alla CK19. Oltre il 21,5% di queste stimolate dal glucosio nel mezzo di coltura risultarono positive per insulina e meno del 3,2% per glucagone. La percentuale di cellule immunopositive per glucosio risultò dipendente dalla concentrazione di glucosio nel mezzo; si è osservato che la concentrazione di 17,8 mM/L di glucosio nel mezzo di coltura ha effettivamente stimolato la secrezione di insulina-glucagone di queste cellule. Conclusioni: Le cellule staminali provenienti dal dotto di wirsung del maiale sono capaci di proliferare in vitro ed hanno la potenzialità, indotta dal glucosio, a differenziarsi in cellule β-simili producenti insulina.